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INFECCIONES HERPETICAS  

Parte 4


Prof. L. Olmos
Dermat
ología de la Universidad Complutense de Madrid

 

6.    DIAGNOSTICO DE LA INFECCION HERPETICA MÁS FRECUENTE

 

Siguiendo las  normas clásicas del quehacer médico, después de una buena historia clínica, especialmente importante en el caso del herpes genital, y una meticulosa exploración clínica, son importantes los exámenes complementarios de laboratorio, en busca del diagnóstico diferencial y por fin el diagnóstico definitivo que obligue al tratamiento, si es posible, específico y si no paliativo o sintomático, con el consiguiente control y normas de prevención.

El diagnóstico de laboratorio de la infección herpética se basa en los efectos citopáticos producidos por el virus en cuestión, la presencia de los virus o del antigeno vírico y la revelación de los anticuerpos producidos por la infección, pero la base del exito comienza con una buena obtención de la muestra que se debe de analizar. El mejor momento para hacer la toma virológica es en el estadio de vesícula o de pústula, mediante una torunda que, además de recoger el liquido resultante de romper la vesícula o la pústula, debe raspar el fondo y los márgenes de la erosión ocasionada, siendo procesada antes de 4 horas, aunque se puede conservar 24-48 horas a +4ºC y varios meses a -70ºC. En todo caso siempre existen medios de transporte a base de proteinas, como albúmina bovina sérica o gelatina, con una combinación de antibióticos en solución salina tamponada que permite mantener viables los virus para ser procesados el mismo día de la obtención.

 

6.1.    Citología o efecto citopático

Aunque, como ya hemos dicho, hay secreciones víricas inaparentes de personas que han  padecido herpes y han sido correctamente diagnosticadas63 y por tanto son portadores infectantes sin alteraciones celulares, cuando se produce sintomatología clínica es porque hay agresión  de los queratinocitos epidérmicos, dejando signos citológicos que permiten sospechar el agente causante.

6.1.1.    Células de Tzanck

Después de raspar la lesión para desprender el techo de la vesícula o pústula se recoge sobre un portaobjetos, mediante raspado, las células de la base de la erosión resultante y tras la fijación con metanol se tiñe según los métodos Giemsa, Wright-Giemsa o Papanicolau que permiten ver las grandes células de citoplasma balonizado, multinucleadas con inclusiones intranucleares, eosinófilas, redondas u ovaladas, bien limitadas, rodeadas de un halo más claro llamadas inclusiones de Crowdy tipo A o inclusiones de mayor tamaño, peor limitadas y coloración menos neta que las da el aspecto de “lavado” o de “cristal esmerilado”, llamadas inclusiones de Crowdy tipo B,características de las llamadas células de Tzanck y casi patognomónicas de herpes, puesto que alcanza el 95% de especificidad aunque su sensibilidad no sobrepase el 60%.

6.1.2.    Histopatología

Estas agresiones celulares que permiten sospechar el agente etiológico todavía son más patentes con el estudio histopatológico pues la imagen de citolisis epitelial, por degeneración balonizante de sus células, es decir hinchazón progresiva, con el citoplasma eosinófilo, homogenizado, claro, grande, que termina por romper las uniones intercelulares y formar vesículas uniloculares  o por degeneración reticular cuyo edema intracelular provoca la distensión y estallido de las células para formar vesículas multiloculares, limitadas por las membranas celulares más resistentes, infectadas o no, que dan el aspecto reticulado. La citolisis permite diferenciar claramente las vesículas del herpes de otras que son acantolíticas, como las del pénfigo o espongióticas, como las del eccema.

Como en todas las virosis epidermotropas el inicio de la infección comienza por las células basales, incluidos los anejos, por lo que las vesículas uniloculares se agrupan y pueden destruir toda la capa basal, dando la apariencia de localización subepidérmica aunque su origen siempre es intraepidérmico. El techo y los laterales de las vesículas o ampollas están formados por las células con signos de degeneración reticular que no es específica de la infección pues en otras circunstancias, como la espongiosis eccematosa, también puede verse. Las células que flotan en el líquido de las vesículas son balonizadas, algunas multinucleadas con cuerpos de inclusión.

El infiltrado dérmico que provoca la lesión epidérmica se caracteriza por una vasculitis más o menos intensa donde puede haber degeneración fibrinoide de sus paredes e incluso cuerpos de inclusión endoteliales con acumulo de polinucleares perivasculares que rodean la necrosis epidérmica o anexial.

 

6.2.    Virología

La presencia del virus en la lesiones herpéticas puede ponerse en evidencia por diferentes métodos: mediante microscopía electrónica, multiplicación en medios de cultivo o revelado de su capacidad antigénica, en las muestras obtenidas de la lesión

6.2.1.    Microscopía electrónica

Se suele decir que esta técnica es de poca utilidad para el diagnóstico de la infección herpética por el elevado coste del equipo y la baja sensibilidad que tiene, pero no siempre es así, porque, en la actualidad, donde hay medios para cultivar virus suele haber un equipo de microscopía electrónica e independientemente de que se utilice para otros menesteres también puede utilizarse para el diagnóstico de rutina, siendo más fácil de hacer, más rápido y más específico que el cultivo, aunque sigue teniendo el inconveniente de su baja sensibilidad y no poder tipificar el virus.

La técnica consiste en utilizar rejillas previamente cubiertas con una película de carbono, obtenida mediante evaporación en vacío, que servirá de contraste al liquido de la vesícula de la lesión que será coloreado con una solución de ácido fosfotúngstico al 2%, neutralizada con sosa o potasa, durante menos de un minuto, lo que hace que la sal metálica se disponga entre las proteínas víricas y los espacios libres existentes entre las partículas, formando una red electrónicamente densa que permite diferenciar la estructura vírica. Como puede verse esta técnica de coloración negativa puede hacerse en menos de 5 minutos y si se ven virus el diagnóstico de herpes es seguro aunque no se pueda decir que tipo de herpes es.

Sin duda hay técnicas que mejoran la sensibilidad haciendo concentrar los virus mediante centrifugación o con inmunomicroscopía electrónica que además permite tipificar el virus en cuestión. Al método clásico, consistente en poner a reaccionar el posible virus con los anticuerpos monoclonales específicos y ver en la rejilla, por contraste negativo, los inmunocomplejos formados, se puede incorporar muchas mejoras, como la utilización de partículas de oro coloidal que absorben las inmunoglobulinas de los anticuerpos y son más fáciles de contrastar por los electrones, pero ya representa mayor especialización y más tiempo.

Si la histopatología precisa una fijación, deshidratación, inclusión, corte y coloración, el mismo tiempo se precisa para el estudio ultraestructural de los cortes de la biopsia hecha a una lesión herpética, con la ventaja de tener también los cortes semifinos que se pueden estudiar con microscopia óptica y la desventaja del menor número de células que se estudian. El problema es tener el microscopio electrónico activo.

6.2.2.   Cultivo del virus

El cultivo vírico es el método de referencia para el diagnóstico de la infección herpética, por su alta sensibilidad y especificidad, aunque hay una cierta dificultad de crecimiento del VZV en relación con losVHS, por lo que si en estos últimos se puede emplear cualquier línea celular primaria, como las del riñón de conejo o humanas, o continua, como las A-549, las Vero, las del carcinoma pulmonar humano o los fibroblastos humanos diploides121, en el caso del cultivo de VZV las más eficaces son los fibloblastos o cultivos primarios humanos y tanto en unos como en otros, dependiendo también de la concentación del inóculo, actualmente hay técnicas como la del shell-vial que consiste en disponer las monocapas celulares de tal forma que se puedan centrifugar facilitando la penetración del virus en la célula122, con lo que se reduce el tiempo de diagnóstico, de 4 diás para VHS y 2 semanas para VZV a 24-48 horas123.

6.2.3.   Demostración del antígeno viral

Aunque no se vea directamente el virus o sus efectos sobre las células infectadas, se puede ver su capacidad y diferenciación antigénica, permitiendo la tipificación vírica, no solo de los cultivos sino de las muestras tomadas directamente al paciente, que se pone en relación con anticuerpos hiperinmunes policlonales o monoclonales murinos, mediante las más variadas técnicas, como inmunofluorescencia, inmunoperoxidasas, ELISA, aglutinación pasiva, enzimoinmunoensayo, radioioinmunoensayo de fase sólida, hibridación, etc., que todas tienen la gran ventaja con respecto al cultivo de poder tener el resultado en horas en lugar de días y cada vez se aproxima más la sensibilidad y especificidad124

El método más rápido y más extendido es la inmunofluorescencia directa (IFA) con anticuerpos monoclonales por su sencillez y su importante sensibilidad de 70-90%, permitiendo localizar el virus en la célula infectada. Consiste en relacionar el posible virus con el anticuerpo monoclonal específico al que se ha conjugado un antisuero fluorescente que en caso de ser positivo da una fluorescencia verdosa que contrasta con las células teñidas con azul de Evans124.

Se ha extendido ampliamente el método de enzimoinmunoensayo(EIA) que no precisa la integridad de la célula infectada, pudiendo ser conservadas las muestras por congelación. Consiste en añadir el posible virus a un anticuerpo específico y absorbido, llamado capturador, cuya reacción, positiva o no, se detecta mediante otro anticuerpo específico, llamado detector, que puede estar marcado o sino se hace reaccionar un conjugado marcado contra la especie del anticuerpo que se va a detectar124.

Una variante del EIA es el radioinmunoensayo de fase sólida (RIAFS) que, en lugar de utilizar una enzima, utiliza iodo radiactivo (I125), lo que hace una técnica más sensible pero con el inconveniente de la radioactividad que obliga a instalaciones adecuadas y la corta vida media del isótopo.

El método de diagnóstico más reciente, costoso y de técnica más especializada es la hibridación del ADN vírico que permite poner en evidencia la existencia del virus en condiciones subclínicas o de latencia sin lesiones e incluso mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) amplificar el antígeno en los casos de inóculos muy reducidos.

 

6.3.    Serología

La puesta en evidencia de los anticuerpos séricos antiherpéticos no permite esclarecer el diagnóstico del tipo de herpes y solamente tiene alguna utilidad para determinar si se trata de una primoinfección o una infección aguda, con la condición de hacer al menos dos tomas sanguíneas que permitan ver la evolución cuantitativa de los anticuerpos y a pesar de ello, salvo el paso de negativo a positivo, es problemático, no solo en el caso del herpes genital, que la infección por VHS-1 en la infancia puede dejar una inmunidad cruzada con VHS-2 y dar niveles tan bajos o tan poco oscilantes que no permite confirmarlo, sino de todos los herpes porque las técnicas tienen que ser muy precisas y homologadas, las reactivaciones de virus latentes producen oscilaciones incontrolables y las variaciones de los niveles de anticuerpos son muy irregulares de unas personas a otras e incluso en la misma persona de unas épocas a otras.

Recientemente el desarrollo de nuevas tecnologías, como el radioinmunoensayo125 y Western-blot21-23  para anticuerpos específicos frente a glicoproteínas víricas como la gpB y la gG2 permiten la diferenciación serológica específica de los diferentes virus.

 

   

 

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