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DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN VIH


 

C. Rodríguez Martín

 

La infección por VIH puede ser identificada en el laboratorio de diferentes formas:

 

1.       métodos directos, ponen de manifiesto la presencia del virus o de sus componente

2.       métodos indirectos, ponen de manifiesto la respuesta inmune del huésped

MÉTODOS INDIRECTOS

La determinación de anticuerpos frente al VIH es el primer paso que debe realizarse para establecer si una persona está infectada o no por este retrovirus.

Para identificar la presencia de anticuerpos en primer lugar se utilizan las pruebas de screening, que permiten realizar gran número de análisis, a bajo coste, de fácil ejecución y alta sensibilidad. El método mas aceptado dentro de este grupo es el enzimoinmunoanálisis (EIA).

Posteriormente debe realizarse el diagnóstico de confirmación con métodos de máxima especificidad, denominados test confirmatorios. De ellos los mas extendidos son el Western blot (WB) o inmunotransferencia, la inmunofluorescencia (IFI), la radioinmunoprecipitación (RIPA) y enzimoinmunoanálisis de tipo lineal (LIA).

La seropositividad se define por la demostración de la presencia de anticuerpos fren­te a las proteínas virales, con re actividad repetida en las pruebas de screening y posteriormente con alguna de confirmación.

PRUEBAS DE SCREENING

El método más utilizado es el enzimoinmunoanálisis (EIA). Su principio básico es la utilización como antígenos de proteínas víricas, parcialmente purificadas, obtenidas del lisado de células o del sobrenadante de cultivos celulares infectados por el VIH en crecimiento (EIA de primera generación), o por medio de proteínas recombinantes o péptidos sintéticos (EIA de segunda generación). Estos últimos son más sensibles y más específicos que los de primera generación. Dependiendo del mecanismo empleado para detectar la presencia de anticuerpos en la muestra hay distintos EIA: indirecto y competitivo.

En el EIA indirecto, el antígeno viral se fija a un soporte sólido y se incuba con el suero problema. Después se revela con una antiglobulina humana tipo IgG marcada con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina), que reacciona con un substrato específico de forma proporcional a la cantidad de anticuerpo s Anti-VIH presentes. Con este método se detectan anticuerpos de tipo IgG.

La técnica del EIA competitivo se basa en la distinta afinidad que presentan los anticuerpos exógenos marcados frente al VIH y los del suero problema al enfrentarse con un lisado viral fijado en un soporte sólido. Los EIA indirectos son más sensibles y los EIA competitivos son más específicos.

Los actuales EIA de tercera generación son capaces de detectar toda clase de anti­cuerpos no sólo de tipo IgG, lo cual implica mayor sensibilidad para reconocer la fase de primoinfección por VIH ya que la IgM es el primer marcador que aparece, también es muy útil para diagnosticar la infección pediátrica (IgM e IgA).

Dentro de los EIA aparecidos últimamente cabe destacar dos técnicas: EIA de tipo sandwich (tercera generación) y EIA de captura. Utilizan como antígenos péptidos sintéticos y proteínas recombinantes específicos del VIH-1 (en muchos ensayos junto con los del VIH-2).

La sensibilidad del EIA es muy buena, lo cual asegura que un resultado negativo, en la mayoría de los casos, significa que una persona no está infectada. Esto hace que sea la técnica a emplear en el screening de gran número de muestras. Por otra parte, su gran sensibilidad hace que exista la posibilidad de falsos positivos, por lo cual es necesario uti­lizar una prueba de confirmación.

Se han descrito falsos positivos en caso de enfermedades de tipo autoinmune, procesos linfoproliferativos y en pacientes africanos (mayor heterogeneidad del virus en África y la hipergammaglobulinemia debida a infecciones parasitarias), en ellos también se puede encontrar falsos negativos.

PRUEBAS RÁPIDAS

Hay una serie de EIA rápidos que permiten detectar sin necesidad de instrumental alguno la presencia de anticuerpos Anti-VIH1/2. Existen dos métodos: de aglutinación y de inmunoadherencia.

La técnica de aglutinación utiliza péptidos recombinantes o sintéticos, se realiza con partículas de látex, gelatina o hematíes sensibilizados con proteínas del VIH.

La sensibilidad y especificidad de estas pruebas son semejantes a los EIA convencio­nales. Están especialmente recomendados en países del Tercer Mundo donde no hay ins­trumentos o personal especializado, en países occidentales en situaciones extrahospitalarias y en cualquier lugar donde se necesite la realización urgente de la prueba (se realiza en un tiempo de 8 a 10 minutos).

PRUEBAS COMBINADAS

Desde que en 1991 la FDA (Food and Drug Administration) aprobó la primera prueba combinada de screening para VIH1/2, han aparecido posteriormente otras técnicas para detectar simultáneamente anticuerpo s frente a varios virus (VIH1/2, HTLV-l y HTLV-2). Su sensibilidad y especificidad son buenas y su mayor utilidad es en bancos de sangre. En la actualidad se utilizan mucho en países desarrollados

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN

Existen varias técnicas para poder confirmar los resultados obtenidos en el screening: Western blot (WB), Inmunofluorescencia (IFI), Radioinmunoprecipitación (RIPA), LIA Y modificaciones (RIBA, Matrix, Pepti lav etc ...).

EL WESTERN BLOT

Es la prueba de confirmación más utilizada actualmente debido a su especificidad. Este test emplea antígenos virales obtenidos por cultivo celular; después, mediante electroforesis se separan las distintas proteínas víricas según sus pesos moleculares y se transfieren a un papel de nitrocelulosa, poniéndose éste en contacto con el suero problema. Los anticuerpos se detectan añadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce unas bandas coloreadas al añadir un substrato. De esta forma se detectan anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas del VIH-1. El mayor problema que presenta la técnica de WB es la interpretación de resultados. Desde el punto de vista diagnóstico hay que considerar la presencia de re actividad frente a las siguientes proteínas:

 

 gp 160 precursora de la envoltura env
gp 120 glucoproteína externa env
gp 41 glucoproteína transmembrana env
p 55 precursora del core gag
p 40 precursora del core gag
p 24 proteína principal gag
p 17 proteína de la matriz gag
p 66 transcriptasa inversa pol
p 51 transcriptasa inversa pol
p 32 endonucleasa pol

 

Existen varios criterios mínimos de positividad del Western blot para la infección por VIH-1:

 

Organización Definición de wb positivo
PCR una banda de cada región: env, gag y pol
FDA por lo menos las tres bandas siguientes p24, p31 y gp41
CDC dos bandas que incluyan p24, gp41 o gp120/160
CRSS p24 y gp41 o gp120/160, p31 y gp41 o gp120/160
OMS al menos dos bandas de la envoltura

 

Hay consenso en todos los criterios en definir un WB negativo como aquel que no presenta ninguna banda y WB indeterminado a aquel que presenta bandas que no corresponden a las del mínimo de positividad utilizado, y puede darse en distintas situaciones:

Ante un resultado de WB indeterminado hay que realizar un seguimiento al menos durante seis meses. Si para entonces el WB sigue indeterminado y el paciente no tiene factores de riesgo y está asintomático, puede considerarse negativo.

Aunque el WB sigue siendo el método más utilizado para la confirmación de positividad obtenida en las pruebas de screening, presenta limitaciones como su elevado coste, largo tiempo de realización, necesidad de personal adiestrado, condiciones de la mues­tra y del análisis, diferente valor predictivo de cada banda y diversidad de criterios de interpretación de resultados. Para tratar de paliar esto, ha aparecido en el mercado un sistema informático de semicuantificación de las bandas de WB para limitar las interpretaciones subjetivas.

Por todo ello, junto con la gran tensión emocional creada en el paciente ante un resultado indeterminado de WB, se está sustituyendo últimamente esta técnica por otros métodos de confirmación.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

En esta técnica se utilizan linfocitos infectados por el VIH, fijados con acetona, sobre los que se deposita el suero problema. cuando se añade a esta preparación una IgG humana marcada con fluoresceína se reconoce la reacción antígeno-anticuerpo.

La interpretación de este resultado requiere mucha experiencia. Pueden existir falsos positivos por reacciones cruzadas con antígenos HLA.

Los estudios comparativos efectuados indican que esta prueba tiene una sensibilidad y especificidad similar al WB, aunque su interpretación puede mostrar una gran subjetividad y su realización es más compleja.

RADIOINMUNOPRECIPITACIÓN (RIPA)

En esta técnica se emplean antígenos víricos previamente marcados con un isótopo radioactivo posteriormente se les hace reaccionar con el suero problema. Los complejos antígeno-anticuerpo formados se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida, se pone en contacto con rayos X y se revela, apareciendo diversas bandas que corresponden a las diferentes proteínas víricas unidas a los anticuerpos del paciente.

Los patrones son similares a los del WB pero el RIPA es más sensible para detectar los anticuerpos anti-gp120/160 por lo que su empleo está indicado para confirmar seroconversiones más precozmente que el WB. Su utilización se recomienda en situaciones de repetidos WB indeterminados, en personas con factores de riesgo para el VIH. Sin embargo es una técnica compleja limitada a laboratorios especializados.

INMUNOENZIMOANÁLISIS LINEAL (LIA)

Últimamente han aparecido otras técnicas de ayuda a la confirmación de resultados positivos obtenidos en EIA. Muchos de ellos se basan en análisis inmunoenzimáticos de tipo lineal (LlA), incorporan proteínas recombinantes o péptidos sintéticos del VIH1 y VIH2 en un soporte plano. Su sensibilidad y especificidad son buenos y en algunos casos son técnicas automáticas lo que resta subjetividad a la hora de interpretar resultados.

En países donde no se puedan utilizar pruebas confirmatorias clásicas (WB, IFI, RIPA, etc.) por su elevado coste o por su compleja realización se puede seguir la siguiente estrategia: se analizan las muestras con una primera prueba de screening y las positivas se someten a un segundo test, también de screening, siempre que las dos técnicas sean de distinto diseño, es decir, si la primera prueba es EIA indirecto la segunda deberá ser EIA competitivo o viceversa.

MÉTODOS DIRECTOS

DETERMINACIÓN DE ANTÍGENO VIRAL

Este método consiste en la detección de proteínas del VIH mediante técnicas EIA en el suero, plasma, semen y LCR de los pacientes infectados y en sobrenadantes de cultivos celulares. Existen tres métodos para determinar la antigenémia VIH:

·         Método policlonal, se utilizan anticuerpos policlonales. Con esta técnica se detecta la presencia de antígeno del core y de los antígenos. Con este método se puede detectada presencia de antígenos en etapas precoces de la infección por VIH-l, antes de la aparición de anticuerpo s específicos, así como en etapas más tardías. En pacientes asintomáticos su sensibilidad es baja debido a la formación de inmunocomplejos antígeno-anticuerpo.

La determinación de antígeno no es útil para screening, sin embargo está indicada su realización en las siguientes situaciones:

Últimamente con la aparición de la técnica para la cuantificación de la carga viral, la determinación del Ag p24 ha perdido muchas de sus indicaciones.

CULTIVO VIRAL

El aislamiento y cultivo del VIH se realiza a partir de leucocitos mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de plasma. Se pueden hacer de forma cualitativa o cuan­titativa. Debido a que es un método costoso, requiere tiempo y supone un riesgo para el personal de laboratorio que realiza la técnica, el aislamiento viral se realizará solo en algunas ocasiones determinadas como en la infección en neonatos, en la infección precoz, en estudios de variabilidad genética, para evaluar la sensibilidad a los antirretrovirales y en epidemiología molecular.

IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

DIAGNÓSTICO GENÉTICO DEL VIH

En la mayoría de los casos, para el diagnóstico de la infección por VIH es suficiente con los métodos serológicos para detectar los anticuerpos frente al VIH, pero tienen el inconveniente de depender de la variabilidad antigénica del virus y de la capacidad de respuesta inmune del huésped.

Para cubrir este problema de las pruebas serológicas, disponemos de las técnicas de diagnóstico directo como cultivo viral, antigenémia y detección de ácidos nucleícos. Y hemos visto las ventajas e inconvenientes de los dos primeros.

Las pruebas que evidencian tanto la presencia del genoma vírico como la hibridación directa (dot blot e hibridación in situ) no han dado los resultado que se esperaba, quizás por que el número de linfocitos circulantes infectados es muy reducido. Por este motivo se ha recurrido a técnicas de biología molecular, basadas en la amplificación enzimática, para lograr un número elevado de copias de una secuencia genómica.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Se utiliza fundamentalmente con fines diagnósticos, para la detección de secuencias del VIH-l en muestras de plasma o en PBMC. También nos permite cuantificar el número de copias de ADN del VIH-1, carga proviral.

Hay dos tipos de PCR , cualitativa y cuantitativa. La detección se puede llevar a cabo sobre ADN o sobre ARN. Mediante PCR se han estudiado secuencias genómicas del ADN (ADN proviral). Para realizar la técnica en ARN del VIH-1, la PCR es la misma que en ADN, pero antes de la amplificación hay que convertir el ARN en ADN de doble cadena mediante la transcriptasa inversa (RT), por medio de una reacción enzimática de transcripción. La técnica consiste en una reacción cíclica repetida un número determinado de veces. Cada ciclo consta de varias etapas:

Estos tres pasos constituyen un ciclo. Si se realiza un determinado número de veces, obtendremos millones de copias y así podremos detectar con facilidad los productos amplificados. Posteriormente para su visualización se puede llevar a cabo por medio de luz ultravioleta tras electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio, o bien mediante autorradiografía.

Podemos encontrar falsos positivos debido a contaminaciones, aunque hoy día este problema está ya resuelto; existen también falsos negativos, en este último caso se puede solucionar utilizando mayor cantidad de ADN o bien mayor número de ciclos de amplificación

Doble PCR (nested PCR) se consigue al realizar dos PCR seguidas, utilizando en la segunda de ellas cebadores que copien un fragmento interno de la secuencia amplificada en la primera. Realizando así la amplificación se logra una mayor sensibilidad y especificidad.

Actualmente se utilizan para el diagnóstico otras pruebas genéticas:

TÉCNICAS DE CUANTIFICACIÓN DE CARGA VIRAL

Recientemente se ha empezado a utilizar métodos moleculares para cuantificar el ARN viral en el plasma de los pacientes infectados por VIH-1 (carga viral).Las técnicas disponibles para la determinación cuantitativa de la virémia plasmática son las siguientes:

RT- PCR

Es un método cuantitativo que combina la retrotranscripción y amplificación, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Incluye los siguientes pasos:

1.       Extracción del RNA de la muestra (suero o plasma).

2.       Retrotranscripción del RNA viral a DNA.

3.       Amplificación del DNA viral con cebadores (marcados con biotina) específicos.

4.       Captura del producto de PCR.

5.       Detección y cuantificación mediante espectrofotometría.

El método además incluye la amplificación de un control interno y la construcción de una curva estándar que permite calcular el número de copias de RNA en la muestra.

El ensayo es muy sensible permitiendo detectar valores bajos de RNA en la mayoría de los individuos, hasta de 200 copias/mI de plasma recientemente se ha aumentado la sensibilidad de la misma detectándose hasta 20 copias/ mI.

Se requiere 0.2 mI de plasma y se pueden obtener resultados el mismo día.

Método del DNA ramificado (bDNA)

El fundamento de esta técnica consiste en una serie de hibridaciones tipo "sandwich". A diferencia de la PCR, el método bDNA, no se basa en la amplificación del ácido nucleíco viral, sino en la amplificación y cuantificación de una señal luminosa cuya intensidad está directamente relacionada con la cantidad de ARN viral en la muestra de plasma.

El método consta de los siguientes pasos:

1.       Concentración de los viriones por medio de una centrifugación (23.500 g) del plasma y preparación del pellet viral.

2.       Lisis del pellet viral.

3.       Captura del ARN viral mediante sondas específicas.

4.       Hibridación con moléculas de bDNA (amplifiers).

5.       Hibridación con sondas marcadas con fosfatasa alcalina.

6.       Incubación en presencia de un substrato quimioluminiscente (dioxetano).

7.       Cuantificación de la emisión de luz por medio de un luminómetro.

La sensibilidad del ensayo es de 500 copias/ml, recientemente se ha aumentado hasta 50copias/mI. El método requiere 2ml de plasma y se realiza en dos jornadas de trabajo, con un período de incubación de 18 horas que se lleva a cabo durante la noche.

NASBA

Esta técnica está basada en la amplificación isotérmica del ARN del VIH-1 en la que participan tres enzimas : la retrotranscriptasa (AMV-RT), la RNasa (NASBA-3SR) y la T7 ARN polimerasa.

El ensayo consta de varias fases:

1.       Aislamiento del ARN.

2.       Hibridación de uno de los cebadores, que contiene un promotor T7, a la secuencia diana de la muestra problema.

3.       Elongación del cebador mediante retrotranscripción y la actividad enzimática de la enzima retrotranscriptasa (ADN-ARN).

4.       Degradación de la cadena ARN de la molécula híbrida por acción de la RNasa-H.

5.       Formación de una segunda cadena ADN.

6.       A partir del ADN de doble cadena se sintetiza ARN, para ello es necesaria la actuación de una enzima denominada ARN polimerasa T7 (RNApolimerasa-­ADN dependiente). Mediante esta enzima se formarán, a partir del ADN de doble cadena, un número elevado de copias de ARN. Cada una de ellas sirve de molde para la nueva síntesis de una copia de ADN y subsecuentemente síntesis de ARN en un segundo ciclo de multiplicación.

7.       La detección se realiza con sondas marcadas con rutenio y posterior lectura mediante electroquimioluminiscencia.

La sensibilidad del ensayo es buena 400copias/ml, hay una variación ultrasensible, que es capaz de detectar hasta 40 copias/ml. El método NASBA puede ser realizado en una jornada de trabajo.

El volumen necesario de muestra 0,1ml.

Es aconsejable que la determinación de carga viral se realice en un laboratorio con experiencia y que esté incluido en un programa de control de calidad.

Estas tres técnicas descritas para cuantificar la carga viral muestran una buena corre­lación entre ellas (r = 0,9) y una sensibilidad más o menos similar (20 a 50 copias/ml). La variabilidad técnica es del orden de 0,2 log y la variabilidad biológica es de aproximada­mente 0,3 log, por tanto, los incrementos o reducciones que no superen los 0,5 log no deben ser considerados como cambios significativos de la viremia.

En la actualidad, la cuantificación de la carga viral tiene las siguientes indicaciones:

1.       Como parámetro de decisión para el inicio de tratamiento y monitorización en un paciente individual.

2.       Como factor pronóstico en el seguimiento de pacientes infectados.

3.       Como parámetro de monitorización de ensayos clínicos.

 

BIBLIOGRAFÍA

 

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